Como funciona la ingenieria genetica?

La revelacion de la estructura del ADN y el descubrimiento de las enzimas de restriccion originaron una de las herramientas mas poderosas de la biotecnologia moderna, la ingenieria genetica; tambien llamada tecnologia del ADN recombinante. La misma, permite estudiar genes, aislarlos e introducirlos en otro organismo.

Identificacion y clonado de genes

Este proceso se utiliza para localizar un gen especifico en un organismo y copiarlo para luego proceder a su estudio. Para ello se debe extraer el ADN del organismo portador del gen en cuestion y cortarlo en pequeños fragmentos utilizando enzimas de restriccion.

Con las mismas enzimas se cortan los plasmidos que se van a mezclar con los segmentos de ADN del organismo en estudio para que se unan y formen plasmidos recombinantes. En este paso suele ocurrir la union de plasmidos entre si, estos deben ser desechados ya que no llevan fragmentos de ADN del organismo de interes.

Los plasmidos recombinantes deben ser introducidos en bacterias para que los genes expresen las proteinas que codifican. Este proceso se realiza generalmente mediante impulsos electricos que abren poros en las membranas bacterianas. Las bacterias que han incorporado los plasmidos son consideradas modificadas geneticamente o transgenicas, las que se seleccionaran por medio de la resistencia al antibiotico que naturalmente lleva el plasmido usado. Aquellas bacterias que no hayan incorporado el plasmido no poseeran dicha resistencia y, por lo tanto, moriran. Las bacterias transformadas creceran y formaran colonias.

Debido a que los organismos poseen miles de genes, se necesitan muchas colonias bacterianas para su estudio. A toda esa coleccion se la denomina biblioteca de genes y los cientificos deben buscar en ella el gen de interes.

Los metodos mas utilizados para evaluar los genes de interes son evaluacion fenotipica, evaluacion con anticuerpos e hibridacion del ADN. En el primer caso se estudia el resultado de la expresion del gen, es decir la proteina que reaccionara con ciertos quimicos y cambiara de color si se ha traducido de manera correcta.

La evaluacion con anticuerpos es similar a la anterior, pero en lugar de utilizar reactivos quimicos se utilizan anticuerpos que reconocen la proteina.

Por ultimo, puede utilizarse una sonda complementaria al segmento que se desea identificar en el cultivo bacteriano. Esta sonda esta marcada radiactivamente y con iluminacion ultravioleta revelara la colonia en la cual hibrido.

Para identificar un gen especifico, realizar mapeos geneticos y estudios evolutivos se utiliza la prueba de Southern blot. En el caso de los organismos geneticamente modificados se usa como prueba definitiva para determinar la incorporacion del transgen al organismo.

El segmento de ADN que lleva el gen que se desea identificar es digerido con enzimas de restriccion y los fragmentos resultantes son separados por electroforesis. Estos son luego desnaturalizados y transferidos a un filtro de nitrocelulosa o membrana de nylon, proceso que preserva la distribucion de los fragmentos del gel creando una replica. Con una sonda marcada radiactivamente se detectara la presencia del gen de interes, el cual sera revelado mediante una autorradiografia que indicara el sitio de hibridacion de la misma.

Por otra parte, si lo que se desea estudiar es el ARN resultante de la transcripcion y sus patrones de expresion se usa la tecnica de Northern blot. Es similar a la anterior, aunque requiere mas cuidado, ya que el ARN es mas susceptible a la degradacion que el ADN.

Los segmentos de ARN se separan en un gel de agarosa y se transfieren tambien a una membrana de nylon o filtro de nitrocelulosa en una placa que contiene una solucion marcada radiactiva o quimicamente. Esta solucion es diseñada especificamente para el segmento que se desea identificar.

La secuencia de ARN marcada es revelada por una autorradiografia, si se usa radiactividad como marcador o por fluorescencia si el marcador usado es quimico.

En el caso de que se quiera detectar la proteina, resultado de la expresion de un gen, la tecnica usada es la de Western blot. Para ello la muestra de proteinas es separada en un gel de poliacrilamida y las bandas son transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Esta se incuba con un anticuerpo especifico para la proteina que se desea identificar.

Creacion de Organismos Geneticamente Modificados (OGM)

La ingenieria genetica permite introducir genes foraneos en el genoma de una determinada especie y lograr que se expresen, es decir que produzcan las proteinas para las cuales codifican. Asi, se han creado cultivos resistentes a plagas, enfermedades y herbicidas; enriquecidos en componentes nutricionales determinados o con propiedades industriales mas deseables.

La produccion de OGM o transgenicos es posible gracias a la universalidad del codigo genetico. Todos los seres vivos fabrican proteinas de la misma manera y esto hace posible que un gen bacteriano pueda expresarse en una planta de maiz o un gen humano lo haga en un animal.

Transformacion genetica en plantas

Para crear una planta transgenica primero debe identificarse y aislarse el gen que produce la caracteristica que se desea incorporar en la misma, luego el gen de interes es clonado en un organismo vector (bacteria) para obtener muchas copias.

El tercer paso de la transformacion consiste en diseñar el gen que se va a introducir. Los genes necesitan para expresarse una secuencia promotora y una terminadora, ademas de la region codificante, la cual lleva las instrucciones para la fabricacion de la proteina. Como los promotores son especificos para cada organismo hay que reemplazarlos por otros que se expresen en la planta, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico de la coliflor, que se expresa en todos los tejidos del vegetal o el promotor de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que pertenece a una enzima fotosintetica y solo se expresa en los tejidos verdes de la misma. Tambien debe incorporarse una secuencia de ADN que permita identificar las celulas que han sido transformadas. Para ello se utilizan genes de resistencia a antibioticos, herbicidas u otros genes marcadores, que luego se expresaran en el medio adecuado y mostraran aquellas celulas que han incorporado exitosamente el transgen.

La ultima etapa de este proceso es la incorporacion del transgen a la planta. Para ello existen diversas metodologias, aunque son solamente dos las mas utilizadas: transferencia directa o metodo de biobalistica y transferencia mediada por un vector.

Transferencia directa de genes

Esta metodologia fue inventada en la Universidad de Cornell en la decada de los 80 y permite la introduccion de ADN en celulas que se hallan en cultivo. Se recubren microparticulas (0,4-0,2 micrometros de diametro) de oro o tungsteno con el ADN que se desea introducir en la planta y se disparan con una “pistola” que funciona, generalmente, con gas helio. La incorporacion del ADN en las celulas es al azar y varia con la distancia y la fuerza del disparo.

Transferencia de genes utilizando un vector

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del suelo que infecta naturalmente a muchas especies vegetales y produce una enfermedad conocida como “agalla de corona”, debido a la proliferacion de tejido en el vegetal que simula un tumor. Estudiando el mecanismo de infeccion de la bacteria se demostro que esta incorporaba en el genoma vegetal una porcion de su ADN plasmidico.

Este plasmido, llamado Ti (inductor de tumores) introduce de manera estable en la celula vegetal una porcion de su ADN, el ADN-T (ADN transferible), portador de la informacion genetica necesaria para que la planta produzca sustancias necesarias para la vida del patogeno (opinas) y ciertas hormonas vegetales como auxinas y citocininas responsables de la proliferacion celular y la consiguiente formacion del tumor.

A partir de este descubrimiento y con la disponibilidad de las enzimas de restriccion, se pudo “desarmar” (eliminarle la capacidad de produccion de tumor) el plasmido Ti e incorporarle ciertos genes de interes para introducirlos en las celulas vegetales.

La obtencion de una planta transgenica por cualquiera de estos dos metodos dependera de la insercion del gen de interes en el genoma de la misma, de su expresion y de la transmision del mismo a su descendencia como si fuera propio, ademas de la posibilidad de regenerar la planta in Vitro.

Luego de la transformacion los tejidos vegetales deben transferirse a un medio de cultivo “selectivo” que contiene el antibiotico o herbicida cuya resistencia codifica el gen marcador, para que solamente crezcan las plantas que han sido transformadas.

Los tejidos que sobreviven a la seleccion se cultivan en condiciones ambientales controladas agregando al medio hormonas y nutrientes esenciales para la generacion de una planta completa. A estas se les hacen diversas evaluaciones como expresion correcta del gen, transmision del mismo a la descendencia, entre otras.

Una vez obtenida una linea o variedad transgenica, la caracteristica de interes puede ser introducida en otras por medio de retrocruzas, es decir por tecnicas de mejoramiento genetico convencional.

FUENTE: asabiotecnologia.com.ar

universidadagricola.com

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