La vacunacion oral con cepas vivas de Salmonella en aves

En los planes de erradicacion de la salmonela que se llevan a cabo en España y toda la Union Europea en la avicultura de puesta y la de carne, la vacunacion de los reproductores es una de las armas mas eficaces con las que se cuenta. En esta presentacion se exponen los objetivos y la tecnica de esta vacunacion, con las ventajas consiguientes para la salud del pollo.

La relevancia de Salmonella spp no se debe a su papel como patogeno, aunque algunas serovariedades pueden causar clinica en aves, sino a su impacto en la salud publica, debido a que es una de las zoonosis mas frecuente en los diferentes paises de la UE y en otros paises del mundo. Las aves, son importantes reservorios de Salmonella spp para los humanos.

El control de la salmonelosis se ha hecho un imperativo legal desde la aprobacion de diferentes directivas relacionadas con diversas zoonosis (2002/99/CE y 2003/99/CE) y de su transposicion en el ambito nacional (RD 1976/2004 y RD 1940/2004). Por ello, los diferentes agentes implicados en la produccion, manipulacion y distribucion de animales y de productos de origen animal han de implicarse directamente en el seguimiento, control y, en la medida de lo posible, erradicacion de las diferentes zoonosis que pudieran estar implicadas en toxiinfecciones alimentarias.

La presencia de Salmonella spp en las granjas avicolas supone un problema para el comercio de carne de pollo y ovoproductos en Europa.

Hasta hace pocos años la mayoria de infecciones humanas tenian su origen en aves, o en productos aviares, y la mayor proporcion de casos positivos de salmonelosis en animales se detectaban en granjas avicolas. Sin embargo, en los ultimos años han aumentado los aislamientos de Salmonella spp a partir de otras especies destinadas al abastecimiento de carne de consumo, especialmente en porcino.

La ruta principal de entrada de Salmonella en el organismo es la ruta oral, por ingestion de alimentos contaminados o por contacto directo con un portador.

Desde este punto, los microorganismos tienen acceso al tracto gastro-intestinal, y, una vez alli, invaden los enterocitos y las celulas M (celulas de la mucosa intestinal), proliferando dentro de los fagosomas del epitelio intestinal y en las celulas linfoides (Placas de Peyer). Las infecciones entericas pueden, en algunos casos, generalizarse por paso de las salmonelas a los vasos linfaticos abdominales y, de alli, al torrente circulatorio, produciendose la diseminacion del microorganismo a diversos organos internos: linfonodos mesentericos, bazo, higado, pulmon, articulaciones, sistema reproductor…

Geneticamente, se han definido dos especies dentro del genero Salmonella: Salmonella enterica (LeMinor y Popoff, 1987) y Salmonella bongori (Reeves et al., 1989). Bioquimicamente, pueden diferenciarse claramente las dos especies de Salmonella, y, ademas, se han definido seis subespecies diferentes dentro de la especie Salmonella enterica: I enterica, II salamae, IIIa arizonae, IIIb diarizonae, IV houtenae y VI indica. Dentro del genero Salmonella se incluyen dos especies, seis subespecies y 2324 serovariedades. La lista completa de todas las formulas antigenicas de las diferentes serovariedades del genero Salmonella, esta recopilada en el Esquema de Kauffmann y White.

Figura 1. Porcentaje de hisopos cloacales positivos a Salmonella por PRC en animales vacunados a dia de vida o en contacto con animales vacunados.

Figura 2. Estudio de marcadores de respuesta inmune de mucosa intestinal en animales vacunados con Salmonella Enteritidis. (GIFN: Gamma Interferon, IL2: Interleuquina 2, TNFa: Factor de induccion del Factor de Necrosis Tumoral alfa, MHC I: Complejo Mayor de Histocompatibilidad tipo I, MHC II: Complejo Mayor de Histocompatibilidad tipo II.

A modo de ejemplo, las formulas antigenicas para las serovariedades Enteritidis y Typhimurium son las siguientes: ser Enteritidis 1,9,12:g,m:- y ser Typhimurium 1,4,[5],12:i:1,2. Si analizamos ambas formulas antigenicas, podemos ver la escasa relacion entre estas dos serovariedades de Salmonella enterica.

La forma mas positiva de enfocar el control de un problema infeccioso, con las caracteristicas de la salmonelosis en granjas de produccion, debe aproximarse al enfoque que tienen otras industrias productivas, el analisis y control de puntos criticos. Este enfoque permite conocer cual es el papel que juega cada uno de los diferentes puntos de la cadena de produccion en la transmision o mantenimiento del agente infeccioso, y que medidas -de eliminacion o de prevencion- han de utilizarse en cada punto para minimizar riesgos. El analisis de los diferentes factores, el enfoque epidemiologico de los resultados (analisis del grado de relacion de los diferentes aislados), y una orientacion multidisciplinaria de la investigacion pueden constituir puntos favorables para encontrar soluciones compatibles con las exigencias de los consumidores al mismo tiempo que con las exigencias de los productores.

El aislamiento de Salmonella spp. por el metodo normalizado (metodo ISO), o alguna de sus variantes, es suficientemente largo y laborioso como para hacer deseable un metodo preliminar que permita la eliminacion de las muestras que vayan a dar, muy probablemente, un resultado negativo. En algunos paises europeos, especialmente en Dinamarca (Baggessen et al., 1996), se han utilizando metodos serologicos para realizar el seguimiento del estado actual de la salmonelosis en una determinada explotacion, utilizandose estos metodos para discriminar entre granjas porcinas positivas y negativas. No obstante, la serologia tiene una marcada falta de correlacion con el aislamiento de Salmonella para un determinada muestra/animal.

Como ayuda para el seguimiento y control de la salmonelosis en las granjas de produccion, la deteccion de secuencias genicas especificas, aunque cabe la posibilidad de deteccion de microorganismos no viables, pueden ayudar a realizar el cribado preliminar de las muestras analizadas y centrar los esfuerzos, de los metodos microbiologicos clasicos, en las muestras en las que se obtengan amplificaciones de fragmentos de DNA bacteriano, de tamaños bien definidos, por la utilizacion de “primers” especificos y PCR. En el caso de Salmonella, las secuencias mas utiles para este proposito son las de los genes invA, iroB, spvC, sefA o de la secuencia de insercion IS200.

La expresion de antigenos bacterianos in vitro y su uso como vacunas es una estrategia ampliamente utilizada para la prevencion de agentes infecciosos. No obstante, este tipo de vacunas presentan serias deficiencias ya que, los antigenos expresados in vitro, no siempre se corresponden con los antigenos que expresan los patogenos en el interior del animal. Este hecho es de extraordinaria importancia cuando los anticuerpos neutralizantes se producen exclusivamente contra antigenos expresados in vivo o en condiciones muy especiales de crecimiento in vitro.

Entre los diferentes antigenos que un patogeno puede expresar in vivo, pero no en las condiciones habituales de crecimiento in vitro, se encuentran las proteinas implicadas en la captacion de hierro (Finley y Falkow, 1997). Este elemento es esencial para el crecimiento y desarrollo de practicamente todos los seres vivos. En los organismos superiores, el hierro en estado libre se halla en concentraciones extremadamente bajas, ya que se encuentra asociado a moleculas, generalmente proteinas, con alta afinidad por el, como por ejemplo la hemoglobina, la transferrina, la lactoferrina o la ovoalbumina (Payne, 1993). Por esta razon, los microorganismos patogenos emplean diferentes estrategias destinadas a captar la cantidad suficiente de hierro para cubrir sus necesidades (Weinberg, 1995).

Una de las estrategias para obtener hierro, por parte de las celulas bacterianas, consiste en la sintesis y excrecion de pequeñas moleculas, conocidas con el nombre de sideroforos, que captan el hierro del medio y facilitan su introduccion al interior de la bacteria, tras interaccionar con receptores especificos que se encuentran en la membrana externa (Earhart, 1996). Este sistema lo presentan fundamentalmente las enterobacterias, Salmonella spp incluida, siendo conocido desde hace años el potencial inmunogenico de las proteinas de membrana receptoras de los sideroforos (Chart y Griffiths, 1985; Griffiths et al., 1985; Boiln y Jensen 1987; Fernandez-Beros et al., 1989). Este hecho ha llevado a sugerir que estas proteinas receptoras de sideroforos pueden ser excelentes inmunogenos (Kingsley et al., 1995).

Por lo anterior puede deducirse que, la utilizacion de cepas vivas atenuadas de Salmonella enterica, puede inducir mayor proteccion de los animales que la utilizacion de vacunas inactivadas crecidas del modo convencional.

Nuestro grupo ha analizado diferentes aspectos, tanto de seguridad como de eficacia, de una cepa viva atenuada (Primum Salmonella E) para el control de Salmonella Enteritidis en ponedoras.

En uno de los primeros estudios, analizamos la persistencia de la cepa vacunal en animales. En este estudio pudimos comprobar que, tres dias despues de la vacunacion, el 99% de los animales vacunados, asi como el 94% de los animales no vacunados en contacto con los primeros, fueron positivos a la cepa vacunal. Este porcentaje de positivos se fue reduciendo paulatinamente, en ambos tipos de animales, hasta negativizarse a los 21 dias despues de la vacunacion (Figura 1). El analisis de IgA secretoria presente en la bilis de los animales, a los 28 dias post-vacunacion, revelo el aumento significativo de anticuerpos anti Salmonella Enteritidis, mediante la tecnica de ELISA, en los animales que habian estado en contacto con la cepa viva atenuada de Salmonella Enteritidis (vacunados o en contacto).

Ademas de la respuesta de anticuerpos, examinamos el grado de expresion de algunos genes relacionados con la respuesta inmunitaria de la mucosa intestinal. Para este estudio se analizo, por PCR-cuantitativa, el grado de expresion relativa de IFN-γ, IL-‑2, TNF-alfa (factor de induccion de TNF-alfa) y de los complejos de histocompatibilidad tipo I (MHC I) y tipo II (MHC II). En la Figura 2 pueden verse los resultados obtenidos, de los que puede inferirse la estimulacion de la expresion de IL-2 y TNF-alfa a los 4 dias de la vacunacion (Figura 2, 4pv). Ademas, tras 4 dias del enfrentamiento con una cepa de campo de Salmonella Enteritidis, se observaria un aumento de expresion de los genes MHC I y MHC II que pueden asociarse con un aumento de celulas presentadoras de antigenos (macrofagos y celulas dendriticas) en los animales vacunados frente a los animales no vacunados (Figura 2, 4pch). Catorce dias despues del enfrentamiento con la cepa de campo de Salmonella Enteritidis, los animales vacunados mostraron una menor estimulacion de los genes IFN-γ, IL-‑2, TNF-alfa, MHC I y MHC II que los animales no vacunados, disminucion que puede representar un aclaramiento mas rapido de la cepa de enfrentamiento en

los animales vacunados (Figura 2, 14pch).

Figura 3. Efecto de la inmunizacion con una cepa viva atenuada sobre la excrecion fecal de Salmonella Enteritidis en ponedoras enfrentadas a una cepa de campo de Salmonella Enteritidis (Final del periodo de inmunizacion, 3ª dosis).

Este mayor aclaramiento de la cepa de campo, utilizada para el enfrentamiento de los animales, puede verse en la Figura 3. En esta grafica se puede ver que la cepa de Salmonella Enteritidis, utilizada para la infeccion experimental de los animales, se fue eliminando progresivamente, hasta dejarse de detectar a los 9 dias, en los animales vacunados; mientras que en los animales no vacunados, esa disminucion progresiva no se observo, manteniendose positivos el 87% de los animales a los 9 dias de la infeccion.

De estos, y otros estudios realizados, podemos inferir el efecto positivo de la inmunizacion, de las futuras productoras o reproductoras, con cepas vivas atenuadas de Salmonella Enteritidis.

Ignacio Badiola Saiz, Judith Gonzalez,  Nuria Aloy y Ana Maria Perez de Rozas. IRTA-Centre de Recerca en Sanitat Animal. ignacio-badiola@cresa.uab.cat Ignacio Badiola ha realizado numerosos trabajos sobre el uso de antimicrobianos o resistencias microbianas, entre otros. Fue miembro del comite cientifico de nutricion animal de la UE durante los años 2000 y 2001 y miembro del grupo asesor sobre antimicrobianos de la European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (2004-2009). Ha sido profesor de la National Autonomous University of Mexico (2004) y presidente de la Asociacion Española de Cunicultura (ASESCU) hasta el año 2012 y vicepresidente de la World Rabbit Science Association. Ha sido experto en salud animal para el INIA y miembro del plan estrategico español para la reduccion del riesgo de resistencias a los antibioticos, responsabilidad con la que continua en la actualidad.

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