Mutaciones utiles para la mejora genetica de horticolas

Las mutaciones son cambios en el DNA o en los cromosomas. En su mayoria, estos cambios solo afectan a un unico nucleotido o a una region muy pequeña del DNA de los miles de millones de nucleotidos que conforman el genoma, pero son los responsables de la variabilidad genetica que observamos. Sin mutaciones, todos seriamos iguales, y lo que es mas importante, no habria posibilidades para la evolucion y la adaptacion. Por tanto, en lugar de una excepcion, podemos decir que todos los individuos de una especies somos mutantes para unos u otros genes. En el caso de las plantas, esta variabilidad genetica ha sido aprovechada por el hombre desde el principio de la agricultura, pues la domesticacion de las especies siempre ha ido acompañada de la seleccion de aquellas variantes geneticas (o mutaciones) mas favorables para el cultivo, la recoleccion, o la calidad de los frutos, semillas, tuberculos, etc. A lo largo del tiempo esta seleccion continuada en diferentes lugares del mundo ha originado distintas variedades adaptadas a las condiciones edafoclimaticas y de manejo del lugar. Asi han surgido las variedades tradicionales o locales, variedades que hoy guardamos como si de oro se tratara en los bancos de germoplasma publicos y privados de todo el mundo.

Las variedades locales vegetales representan la variabilidad genetica natural de la especie, una variabilidad fundamental para la mejora genetica de los cultivos (resistencias geneticas a plagas y enfermedades, tolerancias a estreses abioticos, nuevas formas, tamaños y colores en flores y frutos, etc.). Cuando un mejorador de plantas esta desarrollando una nueva variedad, echa mano de la enorme variacion genetica que nos ha brindado la naturaleza a lo largo de la evolucion de la especie. Las mutaciones naturales han sido, por tanto, la base de la agricultura durante miles de años. Pero, que podemos hacer si no detectamos la variacion que buscamos entre las variedades locales y comerciales de la especie cultivada o especies afines? La solucion pasa por inducir mas variabilidad genetica.

Induccion de mutaciones para la mejora genetica de horticolas

En la actualidad existen dos soluciones para inducir variabilidad genetica en la mejora genetica de especies cultivadas. La primera de ellas es aumentar las tasas de mutaciones naturales en el DNA mediante el uso de mutagenos quimicos o fisicos. Se generan asi miles de nuevas mutaciones al azar, que posteriormente debemos de rastrear para identificar y seleccionar las variantes que nos interesan. Las mutaciones inducidas son iguales que las naturales, por lo que las variedades que se generan a partir de mutaciones inducidas se pueden registrar como variedades tradicionales. La segunda solucion es utilizar la ingenieria genetica para dirigir las mutaciones en un gen concreto de la planta, o para utilizar la variabilidad que brindan el resto de las especies (virus, bacterias, animales y vegetales), transfiriendo un gen desde cualquier especie a la especie cultivada. Estas variedades producto de la ingenieria genetica se deben registrar como variedades transgenicas u organismos modificados geneticamente (OMGs). En el grupo de investigacion Genetica de horticolas de la Universidad de Almeria hemos optado por la primera solucion.

El desarrollo de la genomica y de las tecnicas de secuenciacion y genotipado masivos nos permiten hacer screenings masivos de miles de mutantes, identificando mutaciones en genes concretos. Conocida la secuencia del genoma, la mutagenesis artificial nos ayuda a descubrir la funcion individual de los mas de 25.000 genes que puede tener una planta (Genomica funcional), pero a la vez, el uso de mutagenos genera variantes alelicas que podemos seleccionar para la mejora genetica del cultivo. Por todo ello, en la actualidad contamos con plataformas de mutantes en muchas especies horticolas como tomate (Minoia et al., 2010), melon (Gonzalez et al., 2011), o pepino (Boualem et al., 2014).

Dado que nuestro grupo de investigacion trabaja en mejora genetica de calabacin, hemos desarrollado una coleccion de mas de de 3.700 familias mutantes de Cucurbita pepo (Garcia et al., 2016). Para ello hemos utilizado el mutageno quimico metanosulfonato de etilo (EMS) para tratar las semillas de una variedad tradicional de calabacin español (MUC-16). Esta misma variedad es la que se ha utilizado para secuenciar el transcriptoma y el genoma de calabacin (https://cucurbigene.upv.es/), en cuya consecucion hemos colaborado con los grupos de la Dra. Belen Pico y el DR. Jose Balnca de la UPV. Las mutaciones generadas seran faciles de identificar, pues suponen variantes alelicas diferentes a las del genoma de referencia.

Para caracterizar la calidad de la coleccion de mutantes de calabacin de la UAL, hemos estudiado la variabilidad morfologica de 10 plantulas por familia, lo que ha supuesto la evaluacion de 37.510 plantulas de calabacin en semillero (Figura 1, Tabla 1). A la vez hemos recogido muestras de hoja de cada planta, y una vez agrupadas por familias hemos extraido el DNA de las 3.751 familias. Esta plataforma del ADN de todas las familias mutantes es lo que se llama plataforma de TILLING (Target Induced Local Lessions in Genomes), y se utiliza para hacer screenings basados en cambios en el DNA. El DNA de algunas de las familias ha sido ya secuenciado mediante NGS (New Generation Sequecing). A partir de esta secuenciacion, y centrandonos en las mutaciones que de manera mas frecuente origina el mutageno EMS (C>T o G>A), hemos concluido que nuestros mutantes tienen una media de 5 mutaciones/Mb, una tasa de mutacion muy similar a las detectadas en otras colecciones de mutantes de plantas (Gonzalez et al., 2011; Boualem et al., 2014). El porcentaje de variacion fenotipica, asi como las tasas de mutacion detectadas en la coleccion de calabacin, son muy altas, demostrando que la coleccion tiene una excelente calidad.

Tabla 1. Porcentaje de familias con alteraciones fenotipicas en las plantulas de 3.751 familias mutantes de calabacin. Figura 1. Alteraciones morfologicas en las plantulas de diferentes familias mutantes M2 de calabacin.

Screenings de la coleccion de mutantes de calabacin

Una vez conocida la calidad de la coleccion de mutantes, se estan realizando diferentes screenings para caracteres agronomicos de interes. Para ello utilizamos dos estrategias: primero identificamos el fenotipo mutante de interes y posteriormente la mutacion y el gen responsable del fenotipo (Geneitica directa); o primero identificamos las variantes alelicas en el gen de interes mediante TILLING, y posteriormente comprobamos si el mutante tiene interes para el caracter en el que estamos interesados (Genetica inversa). La primera de las estrategias ha generado ya resultados de interes para la mejora genetica de calabacin.

Screening para insensibilidad a etileno

Dado el gran numero de plantas que tenemos que manejar en cada uno de los screenings (mas de 37.000 plantas), buscamos un test de plantulas que este correlacionado con el caracter de interes en la planta adulta. El primero de los screenings que hicimos fue para insensibilidad a etileno, pues el etileno regula un gran numero de caracteres de interes agronomico: expresion sexual (Manzano et al., 2010, 2011, 2013), cuajado del fruto y partenocarpia (Martinez et al., 2013, 2014), daños por frio durante la poscosecha del fruto (Megias et al., 2014, 2016).

Para buscar mutantes insensibles al etileno en la coleccion, en lugar de crecer las 38.000 plantas en el campo y evaluar sus flores y frutos, lo que hicimos fue utilizar el test de triple respuesta a etileno en plantulas etioladas (Figura 2). Cuando las plantulas crecen en oscuridad en presencia de etileno, estas no se etiolan y muestran un acortamiento del hipocotilo y las raices, a la vez que un engrosamiento del hipocotilo (Figura 2). Por tanto, cualquier plantula que en presencia de etileno no mostrara esta triple respuesta la podemos considerar insensible a etileno. Asi hemos aislado 4 mutantes de calabacin con insensibilidad parcial al etileno: ein1, ein2, ein3 y Ein4 (Garcia et al., 2015; Garcia et al., 2016).

Figura 2. Screening de la coleccion de mutantes de calabacin para insensibilidad a etileno. Izquierda. Bandeja de semillero con plantulas crecidas en oscuridad y en presencia de etileno. Cada linea de la bandeja contiene plantulas de una familia mutante. La mayoria de las plantulas muestran respuesta a etileno y sus hipocotilos son muy cortos (apenas han salido de la turba). Sin embargo, las plantulas etioladas que observamos en una de las familias son insensibles a etileno. Derecha. Plantulas mutantes insensibles a etileno (ein2), intermedias (Intnt) y sensibles (WT) de la familia ein2.

Una vez identificados, los mutantes de esas familias se han cultivado en campo para evaluar sus caracteristicas agronomicas. En este caso, las cuatro familias mutantes mostraron todas ellas alteraciones en la expresion sexual y en el crecimiento del fruto (Figura 3). Tres de las mutaciones (ein1, ein2 y ein3) producen una conversion de flores femeninas en hermafroditas, y de plantas monoicas en andromonoicas, a la vez que muestran un crecimiento partenocarpico de sus frutos, un caracter de enorme importancia en la mejora genetica de calabacin, pues en la actualidad el crecimiento de los frutos de calabacin en invernadero se induce con auxinas sinteticas, una practica que deja residuos en los frutos y para la que estamos buscando alternativas mas sostenibles. El mutante Ein4 mostro un fenotipo androico, es decir, solo produjo flores masculinas. Estamos estudiando la posibilidad de que este mutante androico pueda ser utilizado como polinizador en el cultivo de calabacin ecologico de invernadero, pues el cultivo ecologico no permite el uso de hormonas sinteticas, y las variedades de calabacin comerciales no producen flores masculinas durante los cultivos de invierno, lo que imposibilita tambien la polinizacion

con abejas o abejorros.

Para tratar de buscar las mutaciones implicadas en el fenotipo de estos mutantes, estamos comparando la secuencia obtenida mediante NGS entre plantas WT y mutantes. El estudio comparativo nos ha permitido detectar una mutacion en un gen de etileno que cosegrega con el fenotipo mutante de ein2 (Garcia et al., en preparacion). Este gen esta siendo caracterizado actualmente en nuestro laboratorio.

Figura 3. Flores femeninas normales (a) y hermafroditas (b-c) de calabacin inducidas por mutagenesis. (a) WT, (b) ein1, (c) ein2, (d) ein3.

Los frutos de calabacin son muy sensibles a la frigocoservacion. El transporte y almacenamiento a 4 °C produce diferentes sintomas de daños por frio, que van asociados a una elevada induccion de etileno en las variedades mas sensibles al frio (Megias et al., 2014). Ademas, los frutos de algunas variedades responden positivamente a los tratamientos con el inhibidor de etileno 1-MCP (Megias et al., 2016; 2017). Esperabamos, por tanto, que los mutantes insensibles a etileno tengan una mejor postcosecha y sean mas tolerantes a la frigocoservacion. En el primero de los ensayos que hemos realizado, los frutos del mutante ein1 mostraron una reduccion de sus daños por frio respecto a los frutos WT, pero los de los mutantes ein2 y ein3 no mostraron diferencias significativas con los frutos WT (Figura 4).

Figura 4. Indice de daños por frio (CI) en los frutos WT y mutantes de las familias ein1, ein2 y ein3 a los 7 dias de conservacion a 4

Screening para tolerancia a estres oxidativo

Diversos estudios llevados a cabo en colaboracion con el grupo de la Dra. Dolores Garrido de la UGR, nos han permitido concluir que los daños por frio en el fruto de calabacin estan asociados con la induccion de catabolitos de estres oxidativo (H2O2 y MDA) (Carvajal et al., 2011; Megias et al., 2015; Palma et al., 2016). Por ello, en la actualidad estamos realizando un screening de la coleccion de mutantes para tolerancia a estres oxidativo. Los tratamientos con agua oxigenada son capaces de reducir el crecimiento de la radicula de las semillas en germinacion (Figura 4). Por ello, y con el fin de identificar mutantes tolerantes al estres oxiativo, estamos tratando las semillas en germinacion con una solucion de peroxido de hidrogeno (H2O2) y aminotriazol (AT). Este ultimo inhibe la actividad catalasa (una enzima que cataliza la descomposicion del peroxido de hidrogeno en oxigeno y agua), haciendo que el H2O2 sea aun mas toxico. Las semillas tratadas reducen el crecimiento de su radicula (Figura 5), de forma que cualquier semilla tolerante al tratamiento seria facilmente identificada. Este test ha sido ya utilizado con exito en otras especies vegetales (Gechev et al. 2008).

Figura 5. Semillas de una familia de mutantes de calabacin germinada con agua (izquierda) o con peroxido de hidrogeno (H2O2) y aminotriazol (AT) (derecha).

Hasta el momento hemos hecho el screening de aproximadamente 1000 familias M2 con H202 + AT y se ha detectado una familia donde segregan plantas mas tolerantes al estres oxidativo. Se estan cultivando las plantas mas tolerantes de esta familia para obtener semilla M3 y semilla de backcrossing (BC1) con MUC-16, el fondo genetico donde hemos inducido las mutaciones. A partir de las generaciones M3 y BC2 iniciaremos el fenotipado de las plantas en campo y evaluaremos el potencial agronomico de los mutantes.

Screening para resistencias geneticas a enfermedades

Uno de los problemas mas importantes de la horticultura almeriense bajo invernadero son las plagas y enfermedades, esencialmente las virosis que se transmiten por insectos, y cuyo control escapa de cualquier tratamiento quimico. En el caso de calabacin, las mayores perdidas de produccion y de rentabilidad del cultivo se producen por oidio y por el virus ToLCNDV (Tomato Leaf Curl New Delhi Virus), un Begomovirus trasmitido por mosca blanca que es capaz de infectar a todas las cucurbitaceas pero que esta teniendo efectos devastadores sobre los cultivos de calabacin de Almeria y Murcia. En conlaboracion con la UPV hemos identificado las primeras resistencias geneticas a ToLCNDV en el genero Curcubita (Saez et al., 2016), y estamos investigando para detectar resistencias geneticas a diferentes virus en nuestra coleccion de mutantes. Estos screenings masivos de plantas se van a acelerar con una nueva infraestructura cientifica que se le ha concedido recientemente a la UAL para el fenotipado masivo de plantas horticolas (Figura 6).

Figura 6. Screenings masivos de mutantes para resistencias a virosis en calabacin.

universidadagricola.com

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