Nuevas estrategias para la mejora genetica del contenido en compuestos bioactivos en hortalizas: la berenjena como ejemplo

En muchos cultivos horticolas, los programas de mejora genetica han atendido principalmente a aspectos como la productividad, resistencia a enfermedades, uniformidad del producto y la calidad externa, haciendose poco enfasis en el contenido en compuestos beneficiosos para la salud. Sin embargo, en los ultimos años, existe un interes creciente por parte de los consumidores en productos vegetales mas sanos y que protejan frente a enfermedades. Es por ello que los programas de mejora genetica van paulatinamente incorporando la mejora del contenido en compuestos bioactivos beneficiosos para la salud humana y que prevengan enfermedades entre sus objetivos.

Introduccion

Entre los objetivos mas importantes de mejora del contenido en compuestos bioactivos se encuentra el de incrementar el contenido en sustancias con poder antioxidante. En este sentido, los polifenoles estan adquiriendo un interes creciente por sus multiples efectos beneficiosos, habiendose demostrado que muchos de ellos tienen un alto poder antioxidante (Crozier et al., 2009; Dai y Mumper, 2010). Ademas, muchos de los compuestos fenolicos tienen una gran estabilidad termica, por lo que la degradacion de los mismos es minima incluso despues de ser cocinados o procesados (Friedman y Jurgens, 2000; Lo Scalzo et al., 2010).

Dentro de las especies horticolas, la berenjena (Solanum melongena L.) es una de las mas ricas en compuestos fenolicos (Prohens et al., 2007; Kwon et al., 2008; Raigon et al., 2008; Luthria et al., 2010), lo cual le confiere un alto poder antioxidante (Tabla 1). Es por ello que el desarrollo de nuevas variedades con un mayor contenido en polifenoles es un objetivo de mejora en este cultivo.

La utilizacion de herramientas genomicas puede dar lugar a un importante impulso y a mejorar la eficiencia de los programas de mejora del contenido en polifenoles (Diamanti et al., 2011). A este respecto, en nuestro grupo trabajamos en el desarrollo de herramientas y metodologias modernas, asi como en la obtencion de material vegetal para la mejora del contenido en polifenoles de la berenjena. Asi, el desarrollo de lineas de introgresion, la piramidacion de genes implicados en la ruta de acumulacion de compuestos fenolicos en berenjena (acido clorogenico) y el desarrollo de nuevos marcadores que permitan una seleccion asistida mas eficaz facilitaran la explotacion de la variacion intraespecifica e interespecifica, asi como la aplicacion de metodologias de mejora genetica que permitan conseguir el desarrollo de nuevas variedades con mayor contenido en compuestos bioactivos.

Tabla 1. Comparacion de la capacidad antioxidante (en base a peso seco) de la berenjena (valor relativo 100) y de otras hortalizas segun el metodo ORACROC (modificado de Cao et al., 1996).

Los compuestos fenolicos de la berenjena

Los principales compuestos fenolicos de la berenjena consisten en conjugados del acido hidroxicinamico, los cuales se encuentran en la carne del fruto (Stommel y Whitaker, 2003; Whitaker y Stommel, 2003; Luthria et al., 2010). Las antocianinas presentes en la piel del fruto y responsables del color morado representan una parte relativamente menor en lo que respecta a su contribucion a las propiedades bioactivas del fruto de berenjena (Azuma et al., 2008).

Figura 1. Estructura quimica del acido clorogenico (acido 5-O-cafeoilquinico).

El principal compuesto fenolico de la carne de la berenjena es el acido clorogenico (Figura 1) constituyendo entre un 70 y un 95% de los polifenoles totales de la carne de la berenjena, por lo que en berenjena el contenido en polifenoles totales presenta un alto nivel de correlacion con el contenido en acido clorogenico (Stommel and Whitaker, 2003; Luthria et al., 2010). El acido clorogenico es un potente antioxidante, y se ha demostrado que retrasa el envejecimiento, tiene actividad antitumoral, presenta propiedades cardioprotectoras, actuando como hipotensor e hipolipemiante, y a nivel metabolico es capaz de regular los niveles de glucosa en sangre, inhibir la acumulacion de grasa y muestra propiedades hepatoprotectoras (Sawa et al., 1998; Triantis et al., 2005; Fernandez-Pachon et al., 2008; Kwon et al., 2008; Akanitapichat et al., 2010; Dai y Mumper, 2010; Das et al., 2011; Ma et al., 2014; Zheng et al., 2014; Huang et al., 2014; Onakpoya et al., 2014; Naso et al., 2014; Oboh et al., 2014).

A este respecto, el acido clorogenico presenta una buena biodisponibilidad, tiene un poder antioxidante superior al de la vitamina C o vitamina E y es muy termoestable, de forma que su despues del procesado de alimentos, incluyendo la coccion, fritura, asado, etc., su concentracion no disminuye de forma significativa e incluso en algunos casos, como en berenjena, aumenta (Gazzani et al., 1998; Lo Scalzo et al., 2010). Es por ello que el desarrollo de variedades de berenjena con una mayor concentracion en polifenoles, y en particular de acido clorogenico, en la carne del fruto es de interes en la mejora de la calidad nutraceutica de la berenjena.

Variacion para el contenido en polifenoles en berenjena

Nuestros trabajos previos y los de otros autores muestran que existe una considerable variacion en berenjena para el contenido en acido clorogenico, asi como en polifenoles totales, con diferencias de mas de cinco veces dentro de la especie cultivada, y con valores mucho mas elevados en algunas especies silvestres (Figura 2) que en la cultivada (Stommel y Whitaker, 2003; Whitaker y Stommel, 2003; Hanson et al., 2006; Prohens et al., 2007; Raigon et al., 2008; Okmen et al., 2009).

En nuestro grupo hemos realizado una evaluacion del contenido en polifenoles totales en la carne de berenjena en un amplio numero de variedades de berenjena, de forma que hemos encontrado importantes diferencias en el contenido en polifenoles totales en la especie cultivada que varian desde menos de 200 mg/kg hasta mas de 800 mg/kg en peso fresco (Prohens et al., 2007; Raigon et al., 2008, 2010). En otros estudios mas recientes hemos encontrado que los niveles de acido clorogenico, medidos mediante HPLC, muestran niveles similares de variacion (Figura 3). Esto indica que, tal como hemos comprobado con anterioridad, estos materiales presentan una alta diversidad no solo morfologica y genetica (Prohens et al., 2005; Muñoz-Falcon et al., 2008, 2009a, 2009b, 2011), sino tambien para el contenido en acido clorogenico.

Es de destacar que el valor medio del contenido en polifenoles en las variedades comerciales es, como media, menor que el de los materiales tradicionales (Stommel y Whitaker, 2003; Whitaker y Stommel, 2003; Prohens et al., 2007; Raigon et al., 2008). Este hecho probablemente sea debido a que uno de los criterios de seleccion de las variedades comerciales es que presenten un bajo pardeamiento de la carne del fruto (Figura 4). Dado que los polifenoles al oxidarse dan lugar al pardeamiento de la carne (Macheix et al., 1990), es probable que la seleccion por bajo pardeamiento haya resultado en la seleccion indirecta en las variedades modernas por bajo contenido en polifenoles. En consecuencia, por su menor contenido en polifenoles, las variedades modernas presentan, como media, un menor valor nutraceutico que las variedades tradicionales (Stommel y Whitaker, 2003; Whitaker y Stommel, 2003; Prohens et al., 2007; Raigon et al., 2008).

Figura 2. Materiales de variedades tradicionales de berenjena con amplia diversidad para el contenido en polifenoles (arriba) y de especies silvestres relacionadas con alto contenido en polifenoles (S. incanum: abajo izquierda; S. dasyphyllum: abajo derecha).

Estos resultados muestran que existen fuentes de variacion de gran interes para el desarrollo de nuevas variedades de berenjena con un mayor contenido en polifenoles. No obstante, el exito de una nueva variedad de berenjena rica en polifenoles dependera tambien de conseguir aunar esta caracteristica deseable con una apariencia atractiva, en este caso un grado de pardeamiento bajo. A este respecto, hemos encontrado que existe una correlacion positiva entre el contenido en polifenoles y el grado de pardeamiento. Sin embargo, el porcentaje de variacion total del grado de pardeamiento debido al contenido en polifenoles (parametro r2) es bajo, usualmente inferior al 20%, indicando que otros factores contribuyen de forma sustancial a la variacion en el grado de pardeamiento (Prohens et al., 2007). Asi, varios autores han encontrado diferencias entre variedades de berenjena para la actividad polifenoloxidasa (Dogan et al., 2002; Shetty et al., 2011), lo cual puede dar lugar a diferencias en el grado de pardeamiento de la carne del fruto entre variedades con contenidos similares en polifenoles totales o en acido clorogenico. Asi, es posible encontrar variedades con valores altos para el contenido en polifenoles y

moderados para el pardeamiento (Figura 5).

Por otra parte, es conveniente indicar que aunque algunos compuestos fenolicos tienen sabor amargo (Macheix et al., 1990), el amargor y retrogusto de algunas variedades de berenjena es causado por saponinas y glicoalcaloides (Aubert et al., 1998; Sanchez-Mata et al., 2010) y no por el acido clorogenico, el cual no posee sabor amargo a las concentraciones presentes en berenjena (Nagel et al., 2006).

Figura 3: Cromatogramas (HPLC) representativo en el que se aprecia que el acido clorogenico es el principal compuesto fenolico de la carne de berenjena.

Estrategias modernas de mejora de la calidad nutraceutica en berenjena

Las estrategias convencionales de mejora de la calidad nutraceutica en berenjena se han basado en la obtencion de hibridos entre materiales con alto contenido en polifenoles o el desarrollo de lineas obtenidas a partir de cruzamientos complementarios o transgresivos que permiten obtener materiales con un mayor contenido en polifenoles totales y en acido clorogenico. Por otra parte, las generaciones de retrocruzamiento de la especie silvestre S. incanum hacia S. melongena tambien muestran que es posible seleccionar materiales con mayor contenido en polifenoles. Sin embargo, varios estudios realizados por nuestro grupo muestran que la heredabilidad del caracter contenido en polifenoles totales es moderada (alrededor de 0.50) (Prohens et al., 2007; Raigon et al., 2008; Prohens et al., 2012). Ello indica que, aunque mediante seleccion fenotipica es posible obtener materiales con contenidos altos en acido clorogenico, seria deseable utilizar otro tipo de metodologias, como la seleccion asistida por marcadores moleculares, que mejoren la eficiencia de la seleccion. Es evidente que la utilizacion de aproximaciones que requieren de desarrollos avanzados en el campo de los marcadores moleculares, como el desarrollo de

lineas de introgresion, la piramidacion de genes, o la disponibilidad de nuevos marcadores, pueden suponer un avance considerable en la mejora de la eficiencia de la seleccion (Frary et al., 2007; Daunay, 2008; Perez de Castro et al., 2012).

En este sentido, en nuestro grupo desarrollamos estrategias que pretenden un avance cualitativo en la mejora del contenido en polifenoles en general, y en acido clorogenico en particular, mediante el desarrollo de herramientas que permitan la seleccion a nivel genotipico, de forma que se obtenga una mayor eficiencia en el desarrollo de los programas de mejora.

Figura 4. Variedad con bajo pardeamiento (derecha) y con alto pardeamiento (izquierda). Las secciones de la derecha de cada fruto muestran el aspecto de un corte realizado inmediatamente y las de la izquierda despues de transcurridos 10 minutos.

Desarrollo de lineas de introgresion

Una coleccion de lineas de introgresion es un conjunto de lineas puras con un fragmento de genoma de un donante, habitualmente una especie relacionada, en el fondo genetico de un receptor. De esta forma, una coleccion completa de lineas de introgresion reconstituye el genoma del parental donante en segmentos cromosomicos solapantes y ademas se considera como inmortal, ya que se puede propagar por autofecundacion (Lippman et al., 2007). De esta forma, las lineas de introgresion facilitan el analisis genetico de los caracteres complejos asi como la transferencia de los caracteres de interes propios de las especies silvestres a las especies cultivadas y ademas son muy efectivas para la identificacion y estabilizacion de QTLs, ya que las diferencias fenotipicas entre una linea de introgresion y el parental recurrente se deben unicamente al fragmento introgresado.

A este respecto, las lineas de introgresion permiten una mejor resolucion y deteccion de QTLs que las poblaciones convencionales (Zamir, 2001). En otros cultivos importantes, como el tomate o el arroz, las lineas de introgresion han sido muy utiles para la mejora de caracteres de interes agronomico (Eshed y Zamir, 1995; Monforte y Tanksley, 2000; Lippman et al., 2007; Fukuoka et al., 2010).

Figura 5. Relacion entre el contenido en polifenoles del fruto (g/kg de peso seco) y el pardeamiento de la carne del mismo en una muestra de frutos de berenjena de distintas variedades.

En el caso de la berenjena, la disponibilidad de una coleccion de lineas de introgresion del ancestro silvestre S. incanum en el fondo genetico de S. melongena sera de gran utilidad para identificar las regiones genomicas de esta especie silvestre que presentan QTLs o genes que influyen positivamente en el aumento en el contenido de polifenoles y de acido clorogenico. Por otra parte, la disponibilidad de varias lineas de introgresion que presentan distintos fragmentos cromosomicos de S. incanum y que tienen mayores contenidos en polifenoles permite la realizacion de cruzamientos entre las mismas, de forma que se puedan obtener nuevos materiales complementarios con un contenido mejorado en dichos caracteres de interes nutraceutico. Esta estrategia ha sido demostrada con otros caracteres en otros cultivos (Lippman et al., 2007).

Para la obtencion de una coleccion de lineas de introgresion es necesario disponer de un mapa genetico que cubra el genoma completo, con marcadores distribuidos por el mismo, y con una densidad de marcadores suficiente para alcanzar el objetivo. En nuestro caso disponemos de un mapa genetico obtenido a partir del primer retrocruzamiento hacia S. melongena del hibrido entre S. melongena y S. incanum (Vilanova et al., 2010). Este mapa cubre los 12 grupos de ligamiento de la berenjena y nos ha permitido ir seleccionando materiales en las distintas generaciones de retrocruzamiento, de forma que en estos materiales se encuentra representado el genoma completo de S. incanum. A partir del hibrido F1 y del retrocruzamiento hacia S. melongena (Figura 6) estamos desarrollando una coleccion de lineas de introgresion de S. melongena en la que se encuentre representado el genoma de S. incanum.

Figura 6. Materiales utilizados para el desarrollo de lineas de introgresion que incorporen fragmentos del genoma de S. incanum en el fondo genetico de S. melongena: Solanum incanum (P1), S. melongena (P2), hibrido interespecifico (F1) y primer retrocruzamiento hacia S. melongena (BC1).

Piramidacion de genes

La estrategia de piramidacion de genes consiste en acumular en un solo genotipo, alelos favorables de genes que afectan a un caracter y que han sido identificados en multiples parentales (Joshi y Nayak, 2010; Ishii y Yonezawa 2007a). Los esquemas de piramidacion presentan varias fases. En una primera fase se trata de la identificacion de parentales que presenten alelos favorables para uno o mas genes de interes para la piramidacion (Ishii y Yonezawa, 2007a). De esta forma, se seleccionan un numero minimo de parentales que presenten los alelos deseados que se desean acumular en un solo genotipo. La siguiente fase es la denominada de pedigree, en la que se trata de acumular todos los alelos favorables en un solo genotipo, que se denomina genotipo raiz. En la tercera y ultima fase, conocida como fase de fijacion trata de la fijacion en homocigosis en un unico material de todos los alelos de interes (Ishii y Yonezawa, 2007b).

La piramidacion de genes ha sido ampliamente utilizada en la resistencia a enfermedades en muchos cultivos. Es habitual que para una determinada enfermedad existan varios genes, cada uno de ellos con distintos alelos, y para los cuales es posible construir un genotipo con alelos de resistencia a distintas razas de un patogeno (Joshi y Nayak, 2010; Perez de Castro et al., 2012). Sin embargo, un uso todavia no explorado es la piramidacion de genes implicados en la ruta de sintesis de un compuesto de interes nutraceutico.

En el caso de la berenjena, como en el resto de solanaceas de fruto (Cle et al., 2008), se conoce la ruta de sintesis del principal compuesto fenolico de la carne del fruto (acido clorogenico) (Figura 7).

Figura 7. Ruta de sintesis del acido clorogenico en solanaceas (modificado de Plazas et al., 2013).

A este respecto, los distintos genes de la ruta de acumulacion de acido clorogenico en berenjena (PAL (fenilalanina amonio-liasa), C4H (cinamato 4-hidroxilasa), 4CL (4-cumarato:coenzima A ligasa), HCT (hidroxicinamoil transferasa), C3’H (p-cumaroil-coA 3’-hidroxilasa) y HQT (hidroxicinamoil CoA quinato transferasa)) son conocidos, estando disponible su secuencia (Niggeweg et al., 2004; Comino et al., 2007, 2009; Mahesh et al., 2007; Jöet et al., 2010; Menin et al., 2010), por lo que la busqueda de variantes alelicas es posible mediante la secuenciacion de los alelos presentes en los distintos materiales de berenjena. En nuestro caso, hemos buscado polimorfismos para estos genes entre la especie cultivada y la especie silvestre S. incanum, lo cual nos ha permitido situar los genes de la ruta de acumulacion del acido clorogenico en el mapa genetico que hemos desarrollado. Por otra parte, una vez identificadas distintas variantes alelicas se deben determinar las mas favorables, lo cual puede llevarse a cabo mediante analisis de la expresion genica, tal como se ha realizado en cafe (Lepelley et al., 2007).

Aunque como se ha comentado anteriormente no se han llevado a cabo trabajos de piramidacion para caracteres de calidad en berenjena, si que se dispone de evidencias de que esta estrategia puede ser de efectividad. Asi, Niggeweg et al. (2004) han conseguido plantas de tabaco y tomate que sobreexpresan el gen de la HQT, lo cual induce una mayor acumulacion de acido clorogenico en los tejidos de la planta, lo cual indica que mediante la alteracion de la expresion genica de los genes implicados en la sintesis de acido clorogenico seria posible obtener materiales con una mayor concentracion en este compuesto.

Conclusion

El uso de estas nuevas estrategias para la mejora genetica de la berenjena nos proporcionara una gran cantidad de nuevos recursos genomicos y geneticos que ampliaran de manera cualitativa los ya existentes y que supondran una herramienta util para la mejora genetica del contenido en compuestos bioactivos. En particular, la obtencion de lineas de introgresion y la piramidacion de genes nos permitira obtener materiales de berenjena con un mayor contenido en polifenoles en general y en acido clorogenico en particular. Estos materiales supondran material de elite para el desarrollo de una nueva generacion de variedades comerciales de berenjena con un mayor contenido en compuestos bioactivos. Esta aproximacion moderna puede servir como ejemplo para la mejora de la calidad de otras hortalizas.

Agradecimientos

Los trabajos aqui presentados han sido financiados por el Ministerio de Economia y Competitividad y Feder (proyecto AGL2012-34213) y por la Conselleria d’Educacio i Esport de la Generalitat Valenciana (ayuda ACOMP/2014/191). Pietro Gramazio agradece a la Universitat Politècnica de Valencia la concesion de una beca predoctoral.

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FUENTE: interempresas.net

universidadagricola.com

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