MECANISMOS DE ACCIoN DE Trichoderma FRENTE A HONGOS FITOPAToGENOS

INTRODUCCIoN

En el mundo se conoce un grupo importante de hongos y bacterias que presentan efecto antagonico sobre otros microorganismos. Este efecto es aprovechado por el hombre para la regulacion, tanto de patogenos cuyo habitat es el suelo, como aquellos que se desarrollan en la parte foliar de las plantas (1,2,3,4).

Los antagonistas contribuyen a la atenuacion de los daños que causan las enfermedades, en los agroecosistemas donde existan condiciones para su desarrollo y conservacion. Para lograr este objetivo los microorganismos beneficiosos presentan diferentes modos de accion que les permitan ejercer su efecto biorregulador. Estos atributos, de conjunto con la capacidad de multiplicarse abundantemente, se encuentran entre los de mayor importancia para su seleccion como agentes de control biologico (4).

Desde los primeros estudios en esta tematica y hasta el presente, entre las especies mas ampliamente estudiadas y aplicadas como control biologico, se encuentran las del genero Trichoderma, debido a su eficaz control, capacidad reproductiva, plasticidad ecologica, efecto estimulante sobre los cultivos y recientemente se detecto su accion como inductor de resistencia sistemica en la planta a diferentes patogenos (5,6).

Trichoderma Rifai como un controlador biologico y antagonista natural de fitopatogenos muestra una amplia gama de hospedantes y dentro de ellos estan los hongos fitopatogenos de importancia, tales como: Fusarium oxysporum f. sp. cubense (E.F. Smith) Snyd.y Hans, Fusarium roseum Link, Botrytis cinerea Pers, Rhizoctonia solani Kuhn, Sclerotium rolfsii Sacc. Sclerotinia spp., Pythium spp. Phytophthora spp., Alternaria spp., entre otros.

El objetivo de esta reseña fue realizar una recopilacion y analisis de la informacion relacionada con los diferentes mecanismos de accion de los aislamientos de Trichoderma, los cuales ejercen su actividad antagonica sobre los fitopatogenos.

PARTE ESPECIAL

Aspectos generales de Trichoderma

Las especies pertenecientes al genero Trichoderma se caracterizan por ser hongos saprofitos, que sobreviven en suelos con diferentes cantidades de materia organica, los cuales son capaces de descomponerla y en determinadas condiciones pueden ser anaerobios facultativos, lo que les permite mostrar una mayor plasticidad ecologica. Las especies de Trichoderma se encuentran presentes en todas las latitudes, desde las zonas polares hasta la ecuatorial. Esta distribucion tan amplia y su plasticidad ecologica estan estrechamente relacionadas con la alta capacidad enzimatica que poseen para degradar sustratos, un metabolismo versatil y resistencia a inhibidores microbianos. No obstante, se han realizado pocos estudios acerca de la sobrevivencia, establecimiento y proliferacion de este antagonista en la rizosfera de la planta (7).

El genero Trichoderma es un excelente modelo para ser estudiado debido a su facil aislamiento y cultivo, rapido desarrollo en varios sustratos y por su condicion de controlador biologico de una amplia gama de fitopatogenos (4). Trichoderma se ubica taxonomicamente segun Villegas (8) en:

Reino: Fungi.

Division: Mycota

Subdivision: Eumycota

Clase: Hyphomycetes.

Orden: Moniliales.

Familia: Moniliaceae.

Genero: Trichoderma.

La mayoria de las colonias de Trichoderma en su inicio tienen color blanco, que se tornan a verde oscuro o amarillento, con esporulacion densa (9). El micelio es ralo en su mayoria, y visto al microscopio es fino, los conidioforos son ramificados, parecen un arbol pequeño. Los mismos se presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema de ramas irregular de manera piramidal (Fig. 1). Estos terminan en fialides donde se forman las esporas asexuales o conidios, de gran importancia para la identificacion taxonomica a nivel de especies. Los conidios aseguran las generaciones del hongo durante gran parte del periodo vegetativo de las plantas (9). Son haploides y su pared esta compuesta por quitina y glucanos (3). Ademas de los conidioforos, estas se pueden producir sobre fialides que emergen directamente del micelio.

La mayoria de las especies de Trichoderma presentan clamidosporas, las cuales pueden ser intercalares y en ocasiones terminales. Las clamidosporas toleran condiciones ambientales adversas, son estructuras de sobrevivencia y permiten que el hongo pueda perdurar a traves del tiempo (10).

No obstante, las clamidosporas recien formadas presentan mas de 75% de germinacion, bajo condiciones optimas de humedad (> 75%) y temperatura (28-30oC). Debido a esto se dice, que las especies de Trichoderma produce tres tipos de propagulos: hifas, clamidosporas y conidios (11).

Mecanismos de accion de Trichoderma

En la accion biocontroladora de Trichoderma se han descrito diferentes mecanismos de accion que regulan el desarrollo de los hongos fitopatogenos dianas. Entre estos, los principales son la competencia por espacio y nutrientes, el micoparasitismo y la antibiosis, los que tienen una accion directa frente al hongo fitopatogeno, Leal (2000) citado por Lorenzo (12). Estos mecanismos se ven favorecidos por la habilidad de los aislamientos de Trichoderma para colonizar la rizosfera de las plantas. Otros autores han sugerido distintos mecanismos responsables de su actividad biocontroladora, que incluyen, ademas de los mencionados, la secrecion de enzimas y la produccion de compuestos inhibidores (13,14).

Ademas se conoce que Trichoderma presenta otros mecanismos, cuya accion biorreguladora es de forma indirecta. Entre estos se pueden mencionar los que elicitan o inducen mecanismos de defensa fisiologicos y bioquimicos como es la activacion en la planta de compuestos relacionados con la resistencia (Induccion de Resistencia) (6), con la detoxificacion de toxinas excretadas por patogenos y la desactivacion de enzimas de estos durante el proceso de infeccion; la solubilizacion de elementos nutritivos, que en su forma original no son accesibles para las plantas. Tienen la capacidad ademas, de crear un ambiente favorable al desarrollo radical lo que aumenta la tolerancia de la planta al estres (3).

Competencia

La competencia constituye un mecanismo de antagonismo muy importante. Se define como el comportamiento desigual de dos o mas organismos ante un mismo requerimiento (sustrato, nutrientes), siempre y cuando la utilizacion de este por uno de los organismos reduzca la cantidad o espacio disponible para los demas. Este tipo de antagonismo se ve favorecido por las caracteristicas del agente control biologico como plasticidad ecologica, velocidad de crecimiento y desarrollo, y por otro lado por factores externos como tipo de suelo, pH, temperatura, humedad, entre otros (15,16).

La presencia de forma natural de Trichoderma en diferentes suelos (agricolas, forestales, en barbechos), se considera una evidencia de la plasticidad ecologica de este hongo y de su habilidad como excelente competidor por espacio y recursos nutricionales, aunque la competencia depende de la especie, Wardle et al. (1993) citados por Samuel (17). Trichoderma esta biologicamente adaptado para una colonizacion agresiva de los sustratos y en condiciones adversas para sobrevivir, fundamentalmente, en forma de clamidosporas. La alta velocidad de crecimiento, abundante esporulacion y la amplia gama de sustratos sobre los que puede crecer, debido a la riqueza de enzimas que posee, hacen que sea muy eficiente como saprofito y aun mas como agente de control biologico (16,18).

La competencia por nutrientes puede ser por nitrogeno, carbohidratos no estructurales (azucares y polisacaridos como almidon, celulosa, quitina, laminarina, y pectinas, entre otros) (10,19) y microelementos. Esta forma de competencia en los suelos o sustratos ricos en nutrientes no tiene importancia desde el punto de vista practico. Por ello, cuando se emplea fertilizacion completa o existe exceso de algunos de los componentes de los fertilizantes e inclusive en suelos con alto contenido de materia organica, este tipo de antagonismo es poco eficaz.

La competencia por sustrato o espacio depende de si el mismo esta libre de patogenos (sustrato esteril) o si hay una micobiota natural. En el primer caso, la velocidad de crecimiento del antagonista no determina la colonizacion efectiva de los nichos, sino la aplicacion uniforme del mismo en todo el sustrato. Sin embargo, en el segundo caso la velocidad de crecimiento, conjuntamente con otros de los mecanismos de accion del antagonista, es determinante en el biocontrol del patogeno y colonizacion del sustrato.

Un ejemplo fehaciente de estas interacciones es el notificado por Durman et al. (21), quienes encontraron una disminucion del crecimiento de R. solani y de la viabilidad de los esclerocios por la accion de diferentes aislamientos de Trichoderma spp.

Micoparasitismo

El micoparasitismo es definido como una simbiosis antagonica entre organismos, en el que generalmente estan implicadas enzimas extracelulares tales como quitinasas, celulasas, y que se corresponden con la composicion y estructura de las paredes celulares de los hongos parasitados (11,22,23,24).

Las especies de Trichoderma durante el proceso de micoparasitismo crecen quimiotropicamente hacia el hospedante, se adhieren a las hifas del mismo, se enrollan en ellas frecuentemente y las penetran en ocasiones. La degradacion de las paredes celulares del hospedante se observa en los estados tardios del proceso parasitico (25), que conlleva al debilitamiento casi total del fitopatogeno.

El micoparasitismo como mecanismo de accion antagonica en Trichoderma spp. ha sido ampliamente estudiado, Chet et al. (1998) citados por Perez (18). No obstante, existen aspectos en el mismo que no estan totalmente esclarecidos. Este es un proceso complejo que para su estudio se ha separado en cuatro etapas. El desarrollo de cada etapa depende de los hongos involucrados, de la accion biotrofica o necrotrofica del antagonista y de las condiciones ambientales. Chet y Benhamou (26), explican detalladamente cada una de estas etapas, para el caso de las especies de Trichoderma.

Crecimiento quimiotrofico: El quimiotropismo positivo es el crecimiento directo hacia un estimulo quimico (27). En la etapa de localizacion del hospedante, se ha demostrado que Trichoderma puede detectarlo a distancia y sus hifas crecen en direccion al patogeno como respuesta a un estimulo quimico.

Reconocimiento: Las investigaciones realizadas a lo largo de muchos años con un numero considerable de cepas de Trichoderma y de especies de hongos fitopatogenos han demostrado que estas son efectivas solo contra patogenos especificos. El conocimiento de esta especificidad condujo a la idea de que el reconocimiento molecular entre Trichoderma y el hospedante es el evento esencial que precede al proceso antagonista (26). Esto es un elemento a tener en cuenta para la aplicacion practica de este hongo, y para la busqueda de nuevos aislamientos mas adaptados y eficaces como un proceso continuo.

El reconocimiento se realiza a traves de interacciones lectinas-carbohidratos. Las lectinas son proteinas enlazadas a azucares o glicoproteinas, las cuales aglutinan celulas y estan involucradas en las interacciones entre los componentes de la superficie de las celulas y su ambiente extracelular, Barondes (1981) citado por Chet et al. (26). La produccion de lectinas se ha investigado en R. solani y S. rolfsii . En todos los casos se encontraron evidencias directas, de que las lectinas estan involucradas en el micoparasitismo (18,27).

Adhesion y enrollamiento: Cuando la respuesta de reconocimiento es positiva, las hifas de Trichoderma se adhieren a las del hospedante mediante la formacion de estructuras parecidas a ganchos y apresorios (Fig. 2), se enrollan alrededor de estas, todo esto esta mediado por procesos enzimaticos (18). Segun Chet y Elad (1983), citado por Martinez (20), la adherencia de las hifas de Trichoderma ocurre gracias a la asociacion de un azucar de la pared del antagonista con una lectina presente en la pared del patogeno.

Actividad litica: En esta etapa ocurre la produccion de enzimas liticas extracelulares, fundamentalmente quitinasas, glucanasas y proteasas, que degradan las paredes celulares del hospedante y posibilitan la penetracion de las hifas del antagonista (28). Por los puntos de contacto donde se produce la lisis y aparecen los orificios, penetra la hifa del micoparasito en las del hongo hospedante. La actividad enzimatica en Trichoderma ha sido estudiada extensamente, asi como las posibles funciones que desenvuelven en el micoparasitismo.

Las especies de Trichoderma tienen un elevado potencial parasitico (Fig. 3), con una actividad metabolica muy particular, que les permite parasitar eficientemente las estructuras fungicas de los hongos (1).

Trichoderma excreta muchos metabolitos dentro de ellos enzimas (celulasas, glucanasas, lipasas, proteasas y quitinasas) que participan en la lisis de la pared celular de las hifas del hospedante, facilitando la insercion de estructuras especializadas y de hifas de Trichoderma, que absorben nutrientes del interior del hongo fitopatogeno (19). Misaghi (1984) y Adams (1990) citados por Diaz (11), plantearon que el micoparasitismo finalmente termina con la perdida del contenido citoplasmatico de la celula del hospedante. El citoplasma restante esta principalmente rodeando las hifas invasoras, mostrando sintomas de disgregacion, lo que disminuye la actividad patogenica del mismo.

Desde el punto de vista practico las enzimas se tienen en cuenta como criterio en la seleccion de aislamientos. Elad et al. (29), encontraron que los aislamientos de Trichoderma eficaces en el control de patogenos vegetales eran capaces de producir glucanasas, quitinasas y proteasas, por lo que recomienda que los aislamientos de Trichoderma spp. pueden ser seleccionados como agentes de control biologico en base a su capacidad de producir â-1,3-D glucanasa y quitinasa en presencia de glucano y quitina, respectivamente.

Por los resultados que se han obtenido hasta el momento, se ha llegado a la conclusion que la produccion del factor inhibidor en Trichoderma depende mas del aislamiento que de la propia especie. Aspecto este, que reafirma una vez mas la busqueda constante de nuevos aislamientos de este antagonista (11).

Liu y Baker (1980) citados por Diaz (11), plantearon que el micoparasitismo de Trichoderma sobre R solani es el responsable de la disminucion de la densidad de inoculo de este patogeno y que se corresponde con un incremento en la densidad de poblacion de Trichoderma sp.

Diferentes autores han informado para Trichoderma diferentes tipos de interaccion hifal como parasitismo, considerandolos una potencialidad para su uso como biorreguladores de hongos del suelo (30, 31). Bernal (30), encontro enrollamiento y penetracion de hifas de Trichoderma en hifas de F. oxysporum f. sp. cubense. Harman (32), encontro penetracion en hifas de Pythium sp. y R. solani. Rivero et al. (33), evaluaron cuatro aislamientos de Trichoderma sobre Alternaria padwickii (Ganguly) Ellis, Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoemaker, Curvularia lunata (Wakker) Boedijn y Phoma sp. y obtuvieron una alta capacidad competitiva, con dos o mas tipos de interaccion hifal, excepto en Phoma sp.

Antibiosis

La antibiosis es la accion directa de antibioticos o metabolitos toxicos producidos por un microorganismo sobre otro sensible a estos. Algunos autores opinan que la antibiosis no debe ser el principal mecanismo de accion de un antagonista, ya que existe el riesgo de aparicion de cepas del patogeno resistentes al antibiotico (34). En la practica uno de los antecedentes ha sido el caso de la aparicion de cepas de Agrobacterium tumesfaciens Smith y Townsend resistentes al Agrosin 84, un antibiotico producido por una cepa de Agrobacterium radiobacter Beijerinck y van Del- den (35).

Muchas cepas de Trichoderma producen metabolitos secundarios volatiles y no volatiles, algunos de los cuales inhiben el desarrollo de otros microorganismos con los que no hacen contacto fisico. Tales sustancias inhibidoras son consideradas “antibioticos” (16).

Al inicio se estimo que la actividad inhibidora de aislamientos de Trichoderma sobre otros hongos se debia solo a compuestos no volatiles. Dennis y Webster (36), fueron los pioneros en esta tematica, con la realizacion de los trabajos mas completos acerca de la funcion de los antibioticos producidos por hongos del genero Trichoderma sobre patogenos de las plantas. Ellos relacionaron la actividad antibiotica de Trichoderma spp. con compuestos no volatiles, entre los que se encontraban uno identificado como trichodermina y otros metabolitos peptidicos. En investigaciones posteriores Webster y Lomas (1964) citados por Diaz (11), determinaron que Trichoderma sp. produce dos antibioticos mas: gliotoxina y viridina. Mas tarde Oliver y Germain (37) citado por Martinez (37), informaron que T. harzianum Rifai produce numerosos antibioticos como son: trichodermina, suzukacilina, alameticina, dermadina, trichotecenos y trichorzianina.

Posteriormente, Dennis y Webster (36), detectaron que la actividad antibiotica de algunos aislamientos se debia tambien a la produccion de compuestos volatiles, y notaron que los aislamientos mas activos poseian un fuerte olor a coco, posiblemente relacionado con la actividad antagonista. Los antibioticos volatiles tienen un efecto esencialmente fungistatico, debilitando al patogeno y lo hacen mas sensible a los antibioticos no volatiles, lo que se conoce como un “hiperparasitismo” de origen enzimatico (20).

Stefanova et al. (10), informaron la presencia de metabolitos no volatiles con actividad antifungica en cuatro aislamientos de Trichoderma y concluyeron que los mismos reducen el crecimiento micelial de Phytophthora nicotianae Breda de Haan y R. solani en medios de cultivo envenenado con filtrados liquidos donde se habian cultivado las cepas antagonicas. Plantean ademas, que al parecer estos causan a nivel celular: vacuolizacion, granulacion, coagulacion, desintegracion y lisis. Por otro metodo, Rivero et al. (33), evaluaron el efecto de antibiosis de dos aislados de Trichoderma en cultivo dual con A. padwickii, B. oryzae, C. lunata y Phoma sp., obteniendo inhibicion significativa del crecimiento radial de estos patogenos.

Algunas de las enzimas no solo intervienen en el proceso de penetracion y lisis, sino que actuan tambien como antibioticos, tal es el caso de la enzima endoquitinasa (Ech42) que causa hidrolisis en las paredes de B. cinerea, y ademas inhibe la germinacion de conidios y el crecimiento de tubos germinativos de varios hongos (25).

La produccion metabolica de los aislamientos de Trichoderma presenta, al igual que el micoparasitismo, determinada especificidad. Samuels (17), informa sobre un grupo de cepas de Trichoderma denominado “Q” que produjeron gliotoxina y fueron efectivas frente a R. solani, pero no frente a Pythium ultimum Trow; mientras que otro grupo de cepas “P”, que excretaron gliovirina mostraron resultados opuestos.

No obstante, la maxima eficacia pudiera lograrse con el sistema enzimatico completo (22), inclusive la seleccion tiene que ser mas integral, donde intervengan diferentes modos de accion. Por ejemplo, Martinez et al. (38), observaron al evaluar 59 aislamientos de Trichoderma, competencia por el sustrato, micoparasitismo y antibiosis. En casi todos los aislamientos determinaron al menos un tipo de interaccion hifal bien definida, y algunos de ello presentaron hasta cuatro tipos de interaccion sobre R. solani. Esto favorece el control por un lado y disminuye la posibilidad de que surja resistencia en el patogeno al antagonista (34).

CONCLUSIONES

De este estudio se resalta la importancia que tiene el conocimiento profundo de los mecanismos de accion que pueden presentar los diferentes aislamientos de Trichoderma. Este conocimiento es vital desde el punto de vista practico, debido a que permite una adecuada y mejor seleccion de aislamientos con mayor potencialidad para el control de diferentes fitopatogenos. Mientras mas modos de accion esten presentes en un aislamiento, mayor sera la eficacia del mismo en el control del fitopatogeno, y por ende, menor el daño que puede causarle al cultivo.

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