En el tomate, su presencia puede verificarse en localizaciones muy diversas de la parte aerea de la planta causando sintomatologias de variada naturaleza (Dick y Elad 1999). En efecto, durante el cultivo de tomate ‘B. cinerea’ puede provocar cancro del tallo y podredumbre de hojas, flores y frutos recien cuajados. Los frutos maduros tambien pueden ser infectados en almacen, ya que ‘B. cinerea’ es un importante patogeno de poscosecha (Fig. 1).
Para el control de ‘B. cinerea’ se recurre principalmente al empleo de fungicidas. Estos productos de sintesis han sido utilizados con exito durante largo tiempo, pero al dia de hoy los agricultores comprueban controles insuficientes que responden a una alta versatilidad genetica del patogeno. (Williamson et al. 2007). ‘B. cinerea’ ha desarrollado en un tiempo relativamente corto resistencia a fungicidas de grupos quimicos diferentes como las dicarboximidas, los benzimidazoles, el dietofencarb y los inhibidores de la sintesis del esterol (Yunis y Elad 1989; Gullino 1992; O’Neill et al., 1996; Lamondia y Douglas 1997). Por otra parte, los productos disponibles se enfrentan cada vez mas a la sostenida revision y revocacion de sus usos autorizados y a la vez despiertan una creciente inquietud social por los problemas ambientales asociados a su uso (Greer y Diver 1999).
Esta preocupacion se vuelve extrema, por otra parte, si consideramos que los fungicidas empleados en el control de enfermedades de poscosecha se aplican sobre un articulo listo para su consumo inmediato (Roberts, 1990). Por este motivo en los ultimos años se ha intensificado la prospeccion de alternativas inocuas que permitiesen controlar las enfermedades de poscosecha asociadas a ‘B. cinerea’. Cabe mencionar, en este sentido, experiencias tales como el uso de tratamientos termicos (Fallik et al., 1993), la inmersion en soluciones de bicarbonato potasico (Bombelli y Wright, 2006) o lejia (Mahovic et al., 2004), y el empleo de agentes de control biologico (Mari et al., 1996; Kalogiannis et al., 2006). Durante los ultimos veinticinco años han sido identificados multiples microorganismos de alta efectividad contra ‘B. cinerea’ (Janisiewicz 1988; Helbig 2002) y la eficacia de los mismos como herramienta alternativa o suplementaria al control quimico ha sido ensayada (Köhl et al., 1995; Janisiewicz y Korsten, 2002).
En el CIDEFI (Centro de Investigaciones de Fitopatologia) iniciamos hace aproximadamente diez años investigaciones destinadas a seleccionar antagonistas eficaces para el control biologico de ‘B. cinerea’ sobre tomate en poscosecha. Los primeros trabajos se concentraron en seleccionar dichos antagonistas entre diferentes aislados de levaduras provenientes de biofilms de solanaceas espontaneas y cultivadas. Las levaduras son antagonistas particularmente apropiados para su empleo en poscosecha debido a su alta capacidad inhibitoria, la rapida colonizacion de las heridas y por su modo de accion basado principalmente en la competencia por nutrientes, interaccion fisica directa con las hifas del patogeno y produccion de enzimas activas sobre los componentes de la pared celular (Droby y Chalutz, 1994; Castoria et al., 1997). Con posterioridad, la prospeccion de antagonistas entre los habitantes de la micoflora de los biofilms se hizo extensiva a los hongos filamentosos. Las investigaciones permitieron hallar antagonistas de comportamiento promisorio tanto en este grupo, como dentro de las levaduras (Dal Bello et al., 2008; Monaco et al., 2009). En el presente articulo se describen los aspectos mas relevantes de estos trabajos, expuestos en el Congreso Internacional de Poscosecha de Lleida.
Metodologia
Se relata a continuacion la metodologia empleada en dos ensayos individuales de control biologico. En el primero de ellos se evaluaron como antagonistas diferentes levaduras, mientras que en el segundo los agentes de control biologico empleados fueron distintos hongos filamentosos. En todos los experimentos se empleo una cepa del patogeno ‘Botrytis cinerea’ (Bc11) aislada previamente de frutos infectados. El hongo se mantuvo en cultivo puro en medio artificial (agar patata dextrosa) y se recurrio al mismo cada vez que fue necesario contar con inoculo para los sucesivos ensayos.
La seleccion de las levaduras evaluadas en el primer ensayo se efectuo entre 300 cepas diferentes previamente aisladas del filoplano de distintas plantas solanaceas recolectadas en el area del cinturon horticola de La Plata, Argentina. En esta recoleccion se privilegiaron ambientes que no hubieran estado sometidos a programas de aplicacion de fungicidas y que por lo tanto contaran previsiblemente con micofloras de mayor diversidad. Para el aislamiento se recurrio a la agitacion de trozos de hojas y flores en agua destilada esteril, la dilucion progresiva logaritmica de la suspension y la posterior siembra en placas de Petri con medio de cultivo especifico para levaduras (NYDA, Zhang et al., 2004).
A fin de efectuar una primera seleccion in vitro entre las levaduras se recurrio a la tecnica del cultivo dual (Fig. 2). Para realizar el mismo se sembro sobre una placa de Petri conteniendo PDA un disco de agar de un cultivo de ‘B. cinerea’ en activo crecimiento y transcurridas 24 horas en el extremo opuesto se inoculo la levadura correspondiente sobre la placa mediante la tecnica de siembra en estrias. Al cabo de cinco dias de incubacion el porcentaje de inhibicion en el crecimiento diametral de las colonias de ‘B. cinerea’, asi como el ancho de la zona de inhibicion fueron evaluados y comparados con un testigo.
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Figura 2: Tecnica de cultivo dual mostrando la interaccion entre ‘Botrytis cinerea’ y ‘Candida pelliculosa’.
Las cepas que mostraron mejor comportamiento en el cultivo dual fueron evaluadas posteriormente en su capacidad de inhibir la germinacion de las esporas del patogeno. Para efectuar este ensayo se obtuvo, por un lado, una suspension de conidias de ‘B. cinerea’ y, por otra parte, una suspension de celulas de la levadura. La concentracion de las suspensiones fue ajustada hasta las 107 ufc/µl en el caso del antagonista, y las 105 conidias/µl, en el caso de ‘B. cinerea’. Ambas suspensiones fueron mezcladas y pequeños volumenes de la mezcla fueron transferidos a portaobjetos esteriles que se incubaron bajo camara humeda durante 24 h a 25 °C. Al cabo de la incubacion los portaobjetos fueron observados bajo microscopio y se evaluo el porcentaje de conidias del hongo que habian germinado. Las cepas que mostraron en las pruebas in vitro mejor actividad inhibidora sobre ‘B. cinerea’ fueron escogidas para las posteriores pruebas in vivo.
Las pruebas in vivo se realizaron sobre frutos de tomate Dominique F1 (Hazera Genetics Ltd., Israel) que habian sido mantenidos en almacenamiento a 4 °C durante una semana antes del experimento. Los frutos se esterilizaron superficialmente por inmersion en suspension de lejia durante 15 min, seguida de lavado con agua destilada esteril y secado bajo camara de flujo. Sobre los tomates preparados de este modo se efectuaron tres heridas de 4 mm de profundidad sobre la region ecuatorial con una aguja esteril. Inmediatamente despues sobre cada una de las heridas se aplico un pequeño disco de papel de filtro esteril embebido en una suspension acuosa de la levadura correspondiente. Se dejo secar la suspension sobre la herida durante 30 m a temperatura ambiente y posteriormente encima del disco conteniendo las levaduras se coloco otro de igual diametro embebido en una suspension de conidias de ‘B. cinerea’. Se dispusieron sendos testigos –uno solo con ‘B. cinerea’ y otro solo con levaduras– y los frutos se mantuvieron en incubacion en camara humeda durante siete dias a 20 °C. La severidad de los sintomas fue evaluada posteriormente siguiendo una escala diseñada en funcion del diametro de las lesiones.
En el segundo de los ensayos que se relata en este trabajo la seleccion de antagonistas estuvo dirigida a hongos filamentosos. Para ello se efectuaron aislamientos de cepas presentes en filo y fructoplano de tomates cultivados bajo invernaderos comerciales del area horticola circundante a la ciudad de La Plata. La preseleccion in vitro se realizo sobre 222 aislados recurriendo a la tecnica del cultivo dual. Esto permitio escoger 38 cepas que fueron empleadas en la segunda etapa de ensayo in vivo, efectuada recurriendo a la tecnica oportunamente mencionada para el ensayo de las levaduras (Fig. 3). En esta ocasion el ensayo se efectuo sobre frutos de tomate Superman F1 (Seminis Vegetable Seeds, Inc., USA).
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Figura 3: Bioensayo de control de ‘Botrytis cinerea’ sobre frutos de tomate con hongos filamentosos antagonistas.
Resultados
Entre todas las levaduras aisladas en la prospeccion se escogieron, para las pruebas posteriores, 14 cepas que mostraron una fuerte actividad antagonista en el cultivo dual (crecimiento diametral inferior en 30 a 50 % al registrado en el control; zona de inhibicion superior a 5 mm). Los organismos fueron identificados como cepas de Rodothorula rubra y Candida pelliculosa (Tabla 1).
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Tabla 1: Levaduras seleccionadas y empleadas en el experimento.
Estas cepas mostraron del mismo modo un buen comportamiento en el test de inhibicion de germinacion de esporas, en todos los casos superior al 40% respecto al control (Figs. 4 y 5).
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Figura 4: Efecto de una levadura aislada de filoplano sobre la germinacion de conidias de ‘Botrytis cinerea’ (derecha) y control (izquierda).
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Figura 5: Efecto de las levaduras seleccionadas sobre la germinacion de esporas de ‘Botrytis cinerea’. Las barras de datos que comparten la misma letra no difieren significativamente entre si, segun el test de diferencias minimas significativas (P < 0.05).
En la prueba in vivo los diferentes aislados evaluados difirieron manifiestamente en su capacidad de reducir el desarrollo de las lesiones provocadas por ‘B. cinerea’. Doce de las 14 cepas evaluadas redujeron de un 55 a 100% la incidencia del moho gris y de un 30 a 70% su incidencia respecto del testigo. Las cepas 231, 230, 214, 223, 145, 220, 15, 218, 215, 201, 151 y 210, por otra parte, redujeron significativamente el diametro de las lesiones en comparacion con los testigos no tratados con levaduras (Fig. 6). El maximo control de la podredumbre por moho gris se obtuvo con las cepas 231 y 230 de ‘R. rubra’, que redujeron el desarrollo de las lesiones en mas de un 90%. Las cepas 164 y 209 no produjeron reduccion significativa en los sintomas de la podredumbre mostrandose, por consiguiente, totalmente ineficaces para el control.
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Figura 6: Actividad de 14 aislados de levaduras sobre la severidad de la enfermedad provocada por Botrytis cinerea sobre frutos de tomate. Las barras de datos que comparten la misma letra no difieren significativamente entre si segun el test de diferencias minimas significativas (P < 0.05).
En el experimento de supresion de ‘B. cinerea’ mediante el empleo de hongos filamentosos se seleccionaron, en la primera instancia de evaluacion mediante cultivo dual, 38 aislados que mostraron reducir el crecimiento cultural del patogeno en mas del 50% (Fig. 7). Estos aislados fueron evaluados en la segunda etapa in vivo. En esta ocasion 7 aislados de ‘Cladosporium cladosporioides’, ‘Trichoderma harzianum’, ‘Penicillium sp’ y ‘Alternaria alternata’ mostraron ser significativamente eficaces en el control, ya que redujeron el diametro de las lesiones en mas de un 50% con respecto al testigo inoculado con el patogeno y sin aplicacion de antagonistas. ‘C. cladosporioides’ otorgo la mejor proteccion y redujo el tamaño de las lesiones en mas del 91%.
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Figura 7: Cultivo dual de ‘T. harzianum’ y ‘Botrytis. Cinerea’.
Referencias bibliograficas
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